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尼古丁对人牙周韧带细胞的生物学活性的影响

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作者:朱建华,王泽,邹庆雪 出处:互联网 关键词牙周疾病 牙齿缺失

责编:Chan 发布2011-7-11 11:15:01 阅读

牙周疾病是引起牙齿缺失的主要原因,并已成为广泛的公共卫生问题。吸烟是牙周炎的最危险因素,可加重牙周病并延迟牙周组织的愈合。尼古丁是烟草中的生物碱,既可通过血液对牙周组织产生影响又可以直接作用于牙周组织产生毒害作用。牙周韧带细胞是牙周膜中的主要细胞成分,具有趋化黏附、增殖、生物合成和分化为成牙骨质细胞、成骨细胞,分别形成牙骨质、牙槽骨等多种生物学功能,对牙齿支持组织的维持、再生和损伤修复起极其重要的作用。牙周韧带细胞的数量和协同表现的生物学活性是牙周组织修复的必要保证。本研究以原代培养人牙周韧带细胞为研究对象,从组织形态学和细胞增殖能力两方面探讨尼古丁对人牙周韧带细胞生物学活性的影响,为尼古丁对牙周组织的毒害提供实验依据。

1  材料和方法
1.1  主要试剂和仪器
尼古丁成品(上海晶纯试剂有限公司);二甲基亚砜(DMSO,Sigma,USA);塞唑蓝(MTT,Sigma,USA);超净工作台(杭州恒宇净化设备厂);电热恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司);台式高速离心机、超高速离心机(美国Backman公司);GF-M3000酶标仪(山东高密彩虹分析仪器有限公司)。

1.2  实验方法
1.2.1  取材
征得患者同意将因正畸需要拔除的健康年轻恒牙(拔除前按常规将牙冠及冠周以碘伏消毒,年龄12~22岁),置于含双抗的4℃ Hanks液中,离体后1h之内送达实验室处理。无菌条件下,刮取根中三分之一牙周膜,用镊子将组织块置于一次性培养瓶中同时加入1mL培养液浸润组织块。

1.2.2   牙周韧带的原代培养
将上述培养瓶倒置放于恒温培养箱(37℃,5%CO2),2h后翻转培养瓶补加1mL培养液。24h后小心加液至5mL,防止冲起组织块。培养液为20%胎牛血清,100μg/mL青、链霉素的高糖DMEM培养基,细胞游出前每5天换一次液,细胞游出后每3天换一次液。

1.2.3  尼古丁培养液的配制
用含1%胎牛血清的DMEM完全培养基分别配制含尼古丁的培养液,尼古丁浓度分别为63.4μg/L(低浓度)、126.8μg/L(中浓度)、253.6μg/L(高浓度)[1]。

1.2.4   尼古丁对人牙周韧带细胞增殖的影响
取对数生长期第3代人牙周韧带细胞,0.25%胰酶消化,计数,稀释,以3×105个/mL接种于96孔板内,每孔100μL,培养箱标准环境下培养24h,使其贴壁,更换含1%FBS的DMEM培养液培养24h,使细胞同步化,弃培养液,PBS洗2次,分别加入含低、中、高浓度尼古丁的1%胎牛血清的DMEM培养液200μL,培养24h,每孔加入噻唑蓝溶液20μL培养4h,弃去孔内液体,每孔分别加入DMSO 150μL,震荡10min,酶标仪490波长下测定每孔光密度值(OD)。

1.3  统计学分析
实验数据运用SAS 6.12软件包处理,P<0.05,有显著意义。

2  结果
2.1  形态观察
用组织块法获得的原代细胞(A),贴壁细胞形态较均一,为长梭形,细胞排列紧密,呈漩涡状生长。随尼古丁浓度的增加细胞形态变椭圆或圆形,细胞出现间隙逐渐失去梭形细胞形态。在63.4μg/L的浓度范围尼古丁对牙周韧带细胞的形态无明显影响(B):细胞伸展良好,呈梭形的细长外观。当浓度达到126.8μg/L和253.6μg/L时(C、D),呈现明显的细胞毒性效应,细胞形态改变:细胞皱缩,变圆,伸展差,不贴壁,呈悬浮状态。如下图所示。

2.2  不同浓度尼古丁对人牙周韧带细胞增殖影响
研究结果显示,在加入尼古丁24h后,各浓度的尼古丁实验组均能抑制人牙周韧带细胞的生长,各实验组与对照组比较均有显著性差异P<0.05,其中高浓度尼古丁组对细胞的抑制作用明显强于低浓度和中浓度组。说明在本研究所选的浓度范围内,尼古丁对人牙周韧带细胞的生长呈抑制作用。

3  讨论
牙周韧带细胞是牙周韧带中的主要细胞,具有趋化黏附、增殖、生物合成和分化为成骨细胞、成牙骨质细胞,分别形成于牙槽骨、牙骨质等多种生物学功能,对牙齿支持组织的维持、再生和损伤修复起极其重要的作用。尼古丁有毒性、无色和易挥发,具有水溶性,易溶于水形成水溶性盐。很多研究表明[2],给予不同剂量的尼古丁,特别是啮齿类动物可显示其有害作用。本研究利用体外培养的正常人牙周韧带细胞为实验对象,通过倒置显微镜观察细胞形态,利用MTT分析方法测定尼古丁对细胞增殖的影响。结果表明,尼古丁能抑制体外培养人牙周韧带细胞的增殖。尼古丁抑制细胞增殖的原因可能有:①与其抑制细胞增殖的效应有关,能使处于增殖状态的活细胞阻滞与G2/M,无法进入下一个增殖周期,使牙周韧带丧失自我修复能力。②可能与尼古丁抑制各种酶的活性有关,导致细胞生长未同步。牙周膜细胞是一个具有多种功能的异质性细胞群,包括成纤维细胞,成骨细胞,成牙骨质细胞和未分化的间充质细胞等。其中未分化的间充质细胞具有多向分化潜能,推测在尼古丁的刺激作用下,可抑制分化成牙周组织再生所需的多种细胞,如成纤维细胞,成骨细胞和成牙骨质细胞等。因此将牙周韧带细胞作为靶细胞,研究尼古丁对其影响,明确尼古丁对牙周组织再生和修复中具有的毒害作用,对有效预防和治疗牙周疾病将起到积极作用。

【参考文献】
[1]郑明祺,龚旭龄.烟碱毒理学与吸烟[J].中国药物依赖性杂志,1998,7(2):7276

[2]王小竞,文玲英,杨富生,等.尼古丁对牙乳头间充质细胞增殖的抑制作用[J].实用口腔医学杂志,2000,16(5):369371


 

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