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牙龈卟啉单胞菌对血管平滑肌细胞生物学活动影响研究进展

作者:牙易网 出处:中国实用口腔科杂志 关键词血管平滑肌细胞 牙龈卟啉单胞菌 动脉粥样硬化 

责编:admin 发布2017/12/30 17:07:39 [评论] [推荐] [打印] [关闭]

作者:吴治瑶,张明珠,昆明医科大学附属口腔医院
 
牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是一种产黑色素的革兰阴性厌氧杆菌,是慢性牙周炎发生发展进程中主要的病原体之一。尽管牙龈上皮是P.gingivalis的首要定植部位,但在刷牙、咀嚼等日常活动以及对牙周炎患者行洁治、刮治及根面平整等牙周干预过程中,P.gingivalis可能会穿过受损的牙龈上皮基底膜进入血液循环,并能到达局部或全身血管,引发血管炎症。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)作为动脉血管壁中膜惟一的细胞,在成人正常的血管壁中显示为收缩状态,其增殖及合成水平下降。
 
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发展过程中,在某些炎性因子作用下,VSMCs表型从收缩型向合成型转化,以收缩基因表达下降、增殖、迁移、细胞外基质的产生为AS进展过程的主要特征,进而引发一系列的血管病变。P.gingivalis能黏附至VSMCs表面,侵入细胞内部,诱使细胞表型从收缩型向合成型转变,最终导致血管内皮的增厚。而P.gingivalis的多种毒力因子,如菌毛、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、牙龈蛋白酶对VSMCs表型转化、增殖、钙化等生物学活动方面具有重要的作用。流行病学研究显示,牙周炎是AS的重要危险因素。
 
多个证据显示,在心脏瓣膜病变部位、血栓及AS斑块中均检测到了牙周致病菌,且在AS病变中不仅检测到P.gingivalis特定的DNA分子,同时还发现了活的P.gingivalis存在。Fukasawa等将P.gingivalis的疫苗接种到ApoE-/-小鼠体内后,在其血清中检测到了P.gingivalis抗体,同时,白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β以及AS斑块面积均显著增加。C57BL/6小鼠也出现了同样的变化。
 
潘盛波等将P.gingivalis经尾静脉注射进ApoE-/-小鼠体内后发现,AS斑块面积较对照组增大,主动脉血管壁肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein,MCP)-1均较对照组表达升高;P.gingivalis感染组主动脉组织Toll样受体(toll-like receptor,TLR)-2、TLR4表达较对照组明显升高;核因子(nuclearfactor,NF)-κB活化水平亦明显升高。提示P.gingivalis感染通过TLRs/NF-κB信号通路促进血管局部炎症反应,加速AS的形成。因此,P.gingivalis与AS间的关系研究能更好地揭示牙周感染与AS之间的关联,为临床诊治和从病因学角度防治AS,科学指导牙周病的治疗,降低牙周病治疗过程中心血管疾病并发症的发生。
 
1.P.gingivalis侵入VSMCs的影响
 
P.gingivalis侵入并定植于宿主细胞有5个阶段:黏附、侵入/内化(方式为吞噬和内吞)、运输、持续和清除。细菌在细胞内运输的过程中会修饰细胞内的区室或囊泡,最终破坏细胞的抗菌效应。内化的细菌维持休眠或繁殖状态,从而导致持续性的炎性感染。P.gingivalis具有多种毒力因子,因此本身具有侵袭性和致病性,而P.gingivalis入侵宿主细胞的作用机制仍不明确。P.gingivalis对宿主细胞的黏附作用可能是细菌入侵过程的起始步骤,P.gingivalis的菌毛在侵入宿主细胞过程中发挥了重要的作用。细菌微生物入侵动脉管壁的内皮细胞和平滑肌细胞可能引发亦或加重AS的炎症反应。
 
1999年Dorn等首次通过电子显微镜观察P.gingivalis侵入原代VSMCs和人冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cells,HCAECs)后的细菌定植情况发现,P.gingivalis存在于膜包囊泡中并共同定植于细胞质中,周围被粗面内质网集中包绕。之后又发现P.gingivalis入侵HCAECs25~90min,P.gingivalis从早期的吞噬体转运至自噬体,多数入胞的细菌进入了自噬阶段,除了与溶酶体相关膜蛋白共定位之外,小部分还与组织蛋白酶L(吞噬及自噬溶酶体的蛋白酶)共定位,破坏了细胞正常的自噬途径,因此提示了P.gingivalis侵入宿主细胞引发自噬的同时可能抑制自噬体的成熟,使细菌继续繁殖造成感染持续存在。
 
某些情况下,心血管细胞自噬途径的调节异常可能会导致细胞的“坏死性凋亡”。焦丽宁等将P.gingivalisATCC33277菌株与VSMCs共同孵育VSMCs16h后,透射电镜观察发现细胞膜不再连续,细胞器形态也发生改变,P.gingivalis通过菌毛黏附于细胞表面,入侵至细胞质中,建立损伤破坏细胞的重要通道,而P.gingivalis的菌毛、外膜并未见明显破坏。以上P.gingivalis对VSMCs的入侵损伤途径研究表明,P.gingivalis入侵VSMCs内,最终可能导致细胞凋亡,进一步引发AS的形成。
 
2.P.gingivalis感染对VSMCs生物活性的影响
 
2.1血管生成素(angiopoietin,Angpt)
 
血管再生是AS进展过程中的突出特征。再生过程包括新生血管的增生、血管重组以及血管成熟。Angpt1和Angpt2在调控炎症反应中作用相反。Angpt1是一种抗炎调控分子,通过降低血管的渗透性来调节炎性分子的释放,而Angpt2则是促炎性调控分子。Angpt2主要来源于内皮细胞的棒管状小体(WPBs),亦产生于VSMCs。Angpt2表达的升高已被认为是心血管疾病的标志性分子。现在也认为Angpt2/Angpt1比例增高可能与AS的发病有一定关系。早期研究中发现,P.gingivalisATCC33277菌株作用于人VSMCs后,在上调Angpt2基因表达的同时亦下调Angpt1基因的表达。而之后Zhang等发现,野生型P.gingivalisATCC33277/W50及其精氨酸牙龈素刺激人动脉VSMCs后,Angpt2基因和蛋白的表达均明显升高,而Angpt1的基因表达明显下降。
 
2.2细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule,ICAM-1)
 
ICAM-1在AS形成的早期及进展期发挥重要作用,早期加速单核细胞与内皮细胞的黏附;在进展期一方面促使单核细胞迁移进入内皮后转变为巨噬细胞,而后吞噬脂质转变为泡沫细胞,另一方面能分泌多种炎症介质,导致VSMCs表型转变进而增殖,促使内膜增厚,加速AS形成。林江等将P.gingivalis ATCC33277菌液涂布于SD雄性大鼠的上颌磨牙,并辅以颈部结扎丝,成功建立实验性牙周炎模型,通过免疫组织化学染色法检测可见ICAM-1阳性表达位于VSMCs细胞浆、细胞膜以及细胞间隙。同时体外实验研究亦发现,P.gingivalisATCC33277菌株感染VSMCs16h后,RT-PCR检测ICAM-1表达达到高峰,并持续至24h。以上动物实验及体外细胞实验提示,牙周感染过程中P.gingivalis能通过激活VSMCs中ICAM-1的表达影响血管壁的炎症反应,进而参与AS的发生及发展。
 
2.3IL
 
VSMCs表型由“收缩型”(转分化)向“合成型”(去分化)转化的过程亦受炎性刺激物的影响。Stintzing等通过免疫组织化学及RT-PCR检测发现,处于进展期AS中的VSMCs转分化标志物(细胞角蛋白7/18、β-连环素)以及去分化标志物CD31、CD34的表达较正常组VSMCs明显升高;在IL-1β、IL-6等炎性刺激物作用VSMCs24h后,以上分化标志物的表达水平与未刺激组相比亦明显升高。说明处于炎性环境中的VSMCs具有表型分化潜能,在AS病变形成的早期具有重要的作用。赵瑜敏等用P.gingivalis的上清液刺激VSMCs24h后发现,IL-6的基因和蛋白表达显著增加,而同期IL-1β表达显著降低,提示这两种因子之间可能存在相互影响。因此,P.gingivalis的致病物质可直接刺激VSMCs分泌炎性介质,介导相关的炎性反应。
 
有学者认为,在AS发展过程中,VSMCs与血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)间的相互作用是调节内皮细胞的重要因素。内皮素(endothelin,ET)-1与一氧化氮(NO)是由内皮细胞分泌的相互影响因子,前者具有收缩血管和促细胞增殖作用,后者则舒张血管,抑制VSMCs增殖,是AS发展的内皮保护因子,正常情况下两者共同维持血管内外环境的平衡,平衡状态被打破时可导致血栓和AS斑块形成。李文军等通过Ⅰ、ⅣfimA型P.gingivalis刺激人脐动脉平滑肌细胞(human umbilical smooth muscle cell,HUSMC)-人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)浮胶共培养体系结果与单独刺激HUVEC相比,2h和8h时ET-1的产生情况一致,到24h后ET-1开始下降,推测VSMCs对VECs可能有负调控作用,而NO的产生较单独刺激时多,可能是P.gingivalis刺激VSMCs后亦有NO产生,但未见明确报道。
 
3.P.gingivalis对VSMCs增殖的影响
 
VSMCs增殖并从血管中膜向内膜迁移是AS炎性斑块结缔组织中的主要来源,是AS发展进程中较为重要的细胞。Zhang等用感染指数(MOI)为10∶1的P.gingivalis刺激VSMCs,中性红检测到24h有细胞增殖,48h达高峰,且P.gingiva⁃lis的促VSMCs增殖作用可通过Notch及转化生长因子(transformating growth factor,TGF-β)信号通路进行调控。Inaba等用P.gingivalis上清液与血浆共同孵育VSMCs,能促进VSMCs增殖,且增殖过程呈时间-浓度依赖性,S100A9能调控细胞增殖。
 
赵瑜敏等发现,P.gingivalis上清液除了促进VSMCs增殖外,前4d还能促进VSMCs迁移。提示P.gingivalis的致病物质可能作为刺激因素参与VSMCs增殖迁移的早期阶段。Cao等发现,P.gingivalis的毒力因子牙龈素能显著促进VSMCs增殖,在牙龈素特异性抑制剂(KYT-1/KYT-36)的作用下,VSMCs增殖受到明显抑制。Liu等则发现,P.gingivalis-LPS(1~10000ng/mL)作用VSMCs1d后,能显著促进细胞增殖,且随时间延长,增殖作用越为明显。贾惠杰等着重研究不同基因型P.gingivalis对VSMCs增殖的影响发现,Ⅰ型fimA和Ⅳ型fimAP.gingivalis对VSMCs的增殖作用有差异,Ⅰ型fimAP.gingivalis对VSMCs有明显的促增殖和毒性作用。
 
Mantri等则检测发现,P.gingivalis的胞外膜泡的次级成分,如FimC/D/E等与细菌黏附功能相关的菌毛蛋白能在Ⅰ型fimA P.gingivalis中检测出,而在Ⅳ型fimAP.gingi⁃valis中则缺失。因此不同基因型的P.gingivalis在促VSMCs增殖作用上存在的差异性可能和菌毛的黏附能力与菌毛次级蛋白成分差别有关联。目前P.gingivalis对VSMCs增殖作用的研究仍较少,同时随增殖伴随而来的迁移作用的研究亦较少,除了细菌基因型,细菌的不同致病物质(毒力因子)的作用差异性以及具体机制仍需进一步研究。
 
4.P.gingivalis对VSMCs钙化的影响
 
血管钙化是指AS后期血管壁上钙盐沉积,引起血管硬化以及血管弹性降低的病理现象,是与血管细胞成骨化转变相关的一种主动的、高度可调控的过程。VSMCs、VECs以及肌成纤维细胞、间叶祖细胞均参与形成血管钙化。许多研究已证实,血管钙化与多种骨形成相关分子的表达有关联,如碱性磷酸酶(ALP)、胶原Ⅰ型α1(ColⅠA1)、骨钙蛋白(OC)以及骨桥蛋白(OPN)等。P.gingivalis的膜外囊泡(outer membrane vesicle,OMV)中含有该细菌的多种毒力因子,包括外膜蛋白、胞壁酸、LPS和牙龈素等。OMV可能通过内吞方式经脂筏进入宿主细胞,导致炎症途径的激活。因此可能会与心血管疾病存在一定的联系。
 
Runt相关转化因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)是调节成骨细胞与软骨细胞分化的重要分子,而ERK信号能调控不同细胞增殖、分化、迁移及生存等功能,其激活能促使Runx2的表达升高。Yang等发现,OMV促进VSMCs成骨化及钙化,呈浓度依赖性(0.1~10ng/mL),同时骨形成相关分子(Runx2、ALP、ColⅠA1、OC)以及ERK1/2的基因和蛋白表达均明显升高,运用ERK1/2抑制剂(PD98059)后,以上分子表达水平明显降低。同时进行了体内实验,10ng/mL的OMV刺激C57BL/6小鼠主动脉组织块3周后,通过VonKossa检测发现钙盐在组织块上的沉积现象,PD98059预处理组织块后,钙盐沉积明显降低。以上结果提示,P.gingivalis能通过ERK1/2-Runx2信号通路调控血管钙化,进一步揭示牙周炎与血管钙化存在一定的联系。
 
Cao等发现,P.gingivalis牙龈素能促进VSMCs中OPN的表达升高。Liu等则用P.gingivalis的LPS研究其对VSMCs钙化的影响,通过茜素红染色及RT-PCR检测发现,LPS能促进VSMCs中的矿化沉积,同时矿化基因ALP的表达较正常组明显升高。提示,P.gingivalis的LPS能激活VSMCs钙化,进一步促进血管的钙化发生。
 
5.小结
 
P.gingivalis作为目前公认的牙周致病菌,也是在口腔微生物领域研究广泛的厌氧菌之一。近年来,对P.gingivalis的研究逐渐深入到与心血管疾病相关的基础研究。通过P.gingivalis以及其毒力因子对VSMCs各生物学活动的影响研究,从VSMCs增殖、迁移、炎性介质分泌、钙化等方面,揭示牙周感染与AS发病之间的紧密关联。而在各生物活动分子机制方面的研究较少。因此,P.gingivalis对VSMCs分子水平方面的深入研究,对于科学指导牙周治疗,降低牙周病治疗过程中心血管疾病并发症的发生,进一步提高患者的生活质量具有重要意义。
 
来源:吴治瑶,张明珠. 牙龈卟啉单胞菌对血管平滑肌细胞生物学活动影响研究进展[J]. 中国实用口腔科杂志,2017,10(08):502-506.

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